Rothe等，《BMC补充和替代医学》，(2015) 15:212

DOI 10.1186/s12906-015-0734-0

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类黄酮饮料Haelan 951诱发胰腺癌细胞株体外生长抑制和细胞凋亡

Juliane Rothe、Michael Wakileh、Katrin Dreißiger和Heike Weber[1]

摘要

背景：胰腺癌治疗面临的重要挑战之一在于人类胰腺癌细胞具有抗凋亡能力。有人提出大豆异黄酮和钙蛋白酶的抑制性对癌症发生和发展具有抑制作用。我们研究了含有异黄酮的饮料Haelan 951的和钙蛋白酶抑制剂PD150606对于人胰腺癌细胞株CAPAN-1和BxPC-3、大鼠胰腺癌细胞株AR42J，以及作为对照组的人皮肤成纤维细胞的活性、生长和凋亡的影响。

方法：细胞活性和增殖情况分别通过乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性和WST-1法确定。而细胞凋亡则通过膜联蛋白V-FITC标记细胞、TUNEL法和细胞凋亡蛋白酶活化检测。t检验或曼-惠特尼秩和检验则用于数据对比。

结果：Haelan浓度低于8%时显示无细胞毒性效应，浓度高于8%时引起细胞坏死。与对照组相比，8%的Haelan对于CAPAN-1和BxPC-3细胞株具有显著的生长抑制作用，抑制率分别达到30%和35%。AR42J细胞的增殖速率下降了50%，而成纤维细胞未受影响。研究发现CAPAN-1细胞凋亡增加了1.1倍，而BxPC-3细胞凋亡数量增加了2倍。AR42J细胞和成纤维细胞凋亡数量各增加了1.5倍。钙蛋白酶活性的抑制性增强了Haelan诱发的CAPAN-1和BxPC-3细胞的生长抑制作用，但没有增强对经Haelan处理的AR42J细胞的生长抑制作用。对于成纤维细胞而言，钙蛋白酶抑制性诱发了与独立于Haelan的生长抑制作用。钙蛋白酶抑制性在所有癌细胞株中都提高了Haelan诱导的凋亡活性，但是对于成纤维细胞却没有进一步影响。

结论：Haelan增殖抑制和细胞凋亡诱导作用与细胞类型和给药浓度有很大关系。研究结果首次发现，Haelan可能是治疗人胰腺癌的一个相当有前景的选择，与钙蛋白酶抑制剂同时使用时可能增强Haelan的抗癌活性。

细胞培养

人胰腺癌细胞株BxPC-3和CAPAN-1、大鼠胰腺癌细胞株AR42J和人皮肤成纤维细胞株来自美国标准菌库（美国马里兰州罗克维尔）。AR42J细胞和成纤维细胞在添加了10% (v/v) FCS的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。CAPAN-1细胞株在添加了10% (v/v) FBS的伊思考夫改良杜尔贝可培养基（IMDM）中培养。BxPC-3细胞株在添加了10% (v/v) FBS的无血清细胞冻存培养基（RPMI）中培养。所有培养基中都添加了50 U/ml的青霉素和50 μg/ml的链霉素。细胞培养的环境为37℃，CO2含量5%的加湿空气中。培养过程中使用光学显微镜检查细胞的活性和融合情况。按照制造商的说明，使用accutase细胞消化液分离细胞。

将胰腺癌细胞株和成纤维细胞暴露在浓度不断增加的Hael中

将三种胰腺癌细胞株和人皮肤成纤维细胞（Pro Well：4×104细胞/2 ml细胞培养基）添加到24孔培养板中，其中包括对照培养板和空白培养板。细胞达到亚融合状态后，去除培养基，用浓度逐渐增加的Hael（2%~32%）（包含2 ml对应细胞培养液）分别培养细胞24小时和48小时。对照细胞仅采用培养基进行培养。

将胰腺癌细胞株和成纤维细胞暴露在浓度8%且含有钙蛋白酶抑制剂的Hael中

使用包含或不包含钙蛋白酶抑制剂PD150606 (20 μM)或Ca2+螯合剂BAPTA-AM (10 μM)的两种Hael（浓度为8%）将三种胰腺癌细胞株和人皮肤成纤维细胞培养24个小时。钙蛋白酶抑制剂溶解在二甲基亚砜中，最终浓度为1%。不包含抑制剂的对照细胞和经Hael处理的细胞在溶媒中培养。

细胞活性测定

实验结束后，通过贝克曼库尔特公司（德国克雷菲尔德）购买的乳酸脱氢酶试剂盒和Synchron LX 20分析仪测量释放入培养基中的乳酸脱氢酶，从而评估细胞膜的受损情况。

细胞增殖试验

为了可以采用WST-1法测定细胞增殖速率，可以采用WST-1法。WST-1法的原理是四唑盐WST-1只能在活细胞中裂解，WST-1裂解之后生成可溶性有色甲盐，而这种物质可以通过光度法来测量。细胞培养实验结束后，用磷酸盐缓冲液将细胞冲洗两遍，然后加入含有50 μl WST-1的500 μl细胞培养基。两个小时之后，将Benchmark Plus酶标仪（德国慕尼黑BioRad）的波长调整到450/600 nm，然后测量吸光度。

使用原位细胞死亡检测试剂盒POD检测凋亡细胞

细胞凋亡会导致基因组DNA的裂解。可使用原位细胞死亡检测试剂盒POD检测细胞凋亡细胞凋亡时，在酶促反应中通过修饰核苷能在标记自由3’-OH末端做标记，从而检测出断裂的DNA链。使用细胞在培养载玻片（美国马萨诸塞州贝德福德BD Biosciences公司）中培养细胞，并在添加或不添加浓度为8%的Hael的情况下的条件下培育24个小时。随后加入固定液，搁置2分钟。下一步，添加50 μl TUNEL-POD。接着合上腔室盖玻片，在37℃的温度下培养30分钟。用PBS冲洗三遍之后，在细胞中加入50 μl基质溶液，然后在室温下培养10分钟。之后在透射光显微镜下观察细胞。

使用通过CytoGlo膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒量化细胞凋亡

采集细胞，通过离心操作分离沉淀，然后用PBS冲洗两遍。将等份1×106细胞悬浮在100 μl结合缓冲液（10 mM HEPES、135 mM NaCl、5 mM CaCl2）中，然后添加5 μl染色剂。室温下在黑暗中培养20分钟后，添加400 μl结合缓冲液，接着使用通过流式细胞仪（德国海德堡Becton Dickinson公司，激发波长：488 nm；发射波长：530 nm；软件版本：1.2）每个细胞样本测量10,000个细胞活动。

采用SR-FLICA多细胞凋亡蛋白酶法检测细胞凋亡

使用含有SR-VAD-FMK的磺酰罗丹明FLICA（细胞凋亡蛋白酶的荧光标记抑制剂）细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。FLICA试剂能够穿透细胞，而且没有毒性。它能够与活化的细胞凋亡蛋白酶发生共价反应并停留在凋亡细胞内，而未发生反应的试剂将扩散出细胞。

将等份105细胞置于载玻片上并分别使用不同的细胞培养基，在37℃的温度下培养24个小时。然后，采用浓度8%的Hael将细胞培养24个小时，接着按照制造商的说明使用FLICA溶液。在CO2浓度5%，温度37℃的环境下培养1个小时，然后去除培养基，添加苯基吲哚荧光染料（每300 μl培养基添加1.5 μl），之后继续培养5分钟。最后，使用带通滤波器（红色荧光的激发波长：510–560 nm，发射波长：590 nm）和紫外线滤色器（苯基吲哚染色的激发波长：340–380 nm，发射波长：435–485），在荧光显微镜Nikon Eclipse E600下观察细胞。红色荧光强度与活化细胞凋亡蛋白酶的浓度相关。

统计方法

研究数据采用平均值+标准误差的形式表达。等方差常态分布数据的平均值通过t检验进行对比。如果正态性检验失败，则采用曼-惠特尼秩和检验对比数据。统计过程中使用Jandel Corporation公司（德国埃尔克拉特）的统计软件SigmaStat 3.5。P ≤ 0.05视为统计上显著。

结果

不同Hael浓度对于胰腺癌细胞株和成纤维细胞活性的影响

人胰腺癌细胞株CAPAN-1和BxPC-3、大鼠胰腺癌细胞株AR42J和人皮肤成纤维细胞置于浓度2%~32%的Hael中培养24个小时（图1a-d）。通过测量释放入培养基中的乳酸脱氢酶来测定细胞活性。浓度为2%、4%和8%时，Hael不会对所研究的这几种细胞株带来细胞毒性作用。然而，Hael浓度为16%时则观察到显著的细胞质膜受损情况，导致与对照组相比，CAPAN-1细胞释放的乳酸脱氢酶增加了87%，BxPC-3细胞增加了80%（P < 0.05），AR42J细胞（P < 0.1）和成纤维细胞（P < 0.05）都增加了100%。如果Hael浓度达到32%，则发现所研究的所有细胞株中细胞损伤进一步剧增，尤其是BxPC-3细胞。

结论

尽管Hael诱发生长停滞或细胞凋亡（使用/不使用钙蛋白酶抑制剂或Ca2+结合化合物）的基本机制仍有待阐明，但本研究结果表明，所述药剂适宜用于人类胰腺癌的治疗。

利益竞争

作者声明不存在任何利益竞争。

作者贡献

Heike Weber负责研究设计、统计分析与手稿编纂。Juliane Rothe与Katrin Dreißiger负责开展实验。Michael Wakileh协助进行生物化学分析，润色英文手稿。所有作者已阅读核准本文献终稿。

致谢

在此向内科的Gisela Sparmann博士与Saskia Krohn表示谢意，感谢二位提供CAPAN-1细胞株和BxPC-3细胞株并制作荧光显微图。

修订时间：2014年11月24日；收稿时间：2015年6月18日

在线发布时间：2015年7月3日

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